2020-01-09
2020年1月8日，邦耀生物首席科學(xué)家劉明耀教授和李大力教授帶領(lǐng)團隊與華東師范大學(xué)、廣西醫(yī)科大學(xué)、海南醫(yī)學(xué)院和湘雅醫(yī)學(xué)院通力合作，在國際著名學(xué)術(shù)期刊《Cell Research》共同發(fā)表題為“Reactivation of γ-globin Expression through Cas9 or Base Editor to Treat β-Hemoglobinopathies”的研究成果[1]。通過在造血干細(xì)胞中建立超高效的基因編輯技術(shù)體系，模擬在部分人群中天然存在的γ珠蛋白啟動子突變，可以重新激活胎兒血紅蛋白HbF，為β珠蛋白突變引發(fā)的系列遺傳疾病，包括β-地中海貧血和鐮刀型細(xì)胞貧血癥的治療，提供了安全有效的靶點和方法。此項研究是邦耀科學(xué)家團隊聯(lián)合國內(nèi)多家頂級醫(yī)院血液科攜手完成，最終目的是實現(xiàn)基因編輯技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化，為我國β-地貧患者帶來徹底治愈的療法。
中國是地貧大國，且治療方式有限
據(jù)《中國地中海貧血防治藍(lán)皮書（2015)》的數(shù)據(jù)顯示，目前我國“地貧”基因攜帶者約3000萬人，其中重型和中間型地貧患者約30萬人且正以每年約10％的速度遞增，在我國長江以南地區(qū)，尤以廣西，廣東和海南三省為甚[1]。
目前，針對β-地中海貧血的療法主要有以下幾種，一是輸血替代治療，患者往往需要終身輸血和去鐵治療，由于花費非常大且血源有限，我國患者極少能接受規(guī)范化治療；二是造血干細(xì)胞移植治療，這也是目前唯一可以根治β-地中海貧血的方法，但費用花費巨大，且配型極其困難[2]。如果可以將自體造血干細(xì)胞經(jīng)基因校正后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，則可以解決造血干細(xì)胞來源不足及配型困難的問題。
利用基因編輯技術(shù)引入HPFH良性突變，是一種新的治療策略
臨床研究發(fā)現(xiàn)，在遺傳性高胎兒血紅蛋白癥（Hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）人群中的11號染色體上存在一些突變[3]，導(dǎo)致他們即使在成年期，血液中依然存在高含量（1%-30%）的胎兒血紅蛋白HbF（正常成年人在1%以下）。除此之外，他們和正常人沒有差別。當(dāng)一個β-地貧病人的基因中復(fù)合HPFH的突變時，他的貧血程度一般都會比同種病人更輕，因為胎兒血紅蛋白能夠在功能上補償患者缺失的成人血紅蛋白。
所以，利用基因編輯技術(shù)引入HPFH這種良性突變，重新激活γ珠蛋白基因（HBG）使患者重新生成胎兒血紅蛋白，已經(jīng)成為一種新的基因治療地貧的策略。本研究團隊采用基因編輯技術(shù)模擬HBG啟動子區(qū)13bp缺失和-114C>T這2種HPFH中存在的天然突變，破壞BCL11A結(jié)合域，從而解除其對HBG表達(dá)的抑制，恢復(fù)胎兒血紅蛋白水平，以達(dá)到治療效果[4]。
研究中利用電穿孔的方式將Cas9/sgRNA或A3A-BE3/sgRNA復(fù)合物以RNP形式遞送到細(xì)胞內(nèi)，可以有效避免Cas9蛋白持續(xù)表達(dá)可能引起的安全問題。通過不斷調(diào)整Cas9蛋白的用量，在來源于β-地中海貧血病人的CD34+造血干細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)了HBG啟動子區(qū)的高效基因編輯，平均編輯效率可達(dá)85%以上。同時還首次嘗試了利用單堿基編輯工具h(yuǎn)A3A-Cas9n對BCL11A位點進行編輯。具體策略如下：
1.利用Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)模擬HBG啟動子缺失的HPFH
CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯在HBG啟動子區(qū)產(chǎn)生了13bp的缺失，經(jīng)過體外分化發(fā)現(xiàn)，無論是來源于健康志愿者的CD34+造血干細(xì)胞還是來源于β-地中海貧血病人的CD34+造血干細(xì)胞，胎兒血紅蛋白的含量均顯著提高，且均超過了在臨床上顯示的有益于鐮刀型細(xì)胞貧血癥的水平。同時流式分析與顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過編輯的來源于β-地中海貧血病人的CD34+造血干細(xì)胞分化后更加飽滿圓潤接近正常紅細(xì)胞。同時，研究人員還對編輯后的細(xì)胞進行了脫靶分析，結(jié)果顯示在這些潛在的脫靶位點并沒有產(chǎn)生基因缺失和插入，證實了該編輯策略的安全性。
2.利用單堿基編輯技術(shù)突變HBG啟動子位點破壞BCL11A結(jié)合
此外，該團隊的研究人員首次將單堿基編輯器直接作用于HBG啟動子區(qū)，使-114和-115位點的C突變?yōu)門，重新激活胎兒血紅蛋白的表達(dá)。雖然基因編輯效率只達(dá)到12-18%，但令人驚奇的是，對比體外分化來源于正常志愿者和β-地中海貧血病人的CD34+造血干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，經(jīng)編輯的胎兒血紅蛋白表達(dá)水平與未編輯的相比仍然有較大的提高，為β-地中海貧血的治療提供了新的解決方案。
據(jù)統(tǒng)計，在我國β-地中海貧血的患病率是2.21%，其類型達(dá)48種?；蚓庉嫾夹g(shù)介導(dǎo)的基因治療是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大突破，利用基因編輯技術(shù)重新激活胎兒血紅蛋白的表達(dá)，也為β-地中海貧血的個性化治療提供了可能性。
除了靶向HBG啟動子區(qū)域，邦耀生物還加強了在地貧其他位點的研發(fā)管線拓展。2019年3月25日，國際著名學(xué)術(shù)期刊《Nature Medicine》在線發(fā)表了邦耀科學(xué)家吳宇軒研究員在基因治療方向的研究成果，題為“Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells”。該研究通過基因編輯技術(shù)編輯β-地中海貧血患者的造血干細(xì)胞中的BCL11A增強子位點，并進行自體造血干細(xì)胞移植，編輯后的造血干細(xì)胞可以分化為含有高水平HbF的紅細(xì)胞，有望徹底根治由β-globin珠蛋白突變引發(fā)的系列遺傳疾病。
目前邦耀生物團隊正積極進行科技成果轉(zhuǎn)化，與國內(nèi)多家頂級醫(yī)療單位攜手，希望借此項研究及其臨床實驗的推廣，使得基于基因編輯的基因治療成為我國β-地中海貧血患者全新的臨床治療方案，并有望實現(xiàn)“一次治療終身治愈”的療效。
與在基因治療方面處于領(lǐng)先地位的BlueBird Bio公司的慢病毒療法LentiGlobin (商品名：Zynteglo，Zynteglo是一種基于慢病毒載體的體外基因療法，且定價高達(dá)177萬美元，名副其實的成為了全球第二昂貴的藥物)相比，邦耀生物采用的將Cas9蛋白和sgRNA通過電轉(zhuǎn)染導(dǎo)入患者自體造血干細(xì)胞的治療方案，更為高效、便捷和安全，且成本極大降低。
參考文獻(xiàn)
1.中國地中海貧血藍(lán)皮書-中國地中海貧血防治狀況調(diào)查報告（2015），北京天使媽媽慈善基金會，中國思源工程扶貧基金會，北京師范大學(xué)中國公益研究院編著
2.《地中海貧血預(yù)防控制操作指南》，主編：徐湘民,人民軍醫(yī)出版社, 2011.3, ISBN 978-7-5091-4642-2
3. Wienert B, Martyn GE, Funnell APW, Quinlan KGR, Crossley M: Wake-up Sleepy Gene: Reactivating Fetal Globin for beta-Hemoglobinopathies. Trends Genet 2018, 34(12):927-940.
4. Wang L, Li L, Ma Y, Hu H, et al. Reactivation of γ-globin Expression through Cas9 or Base Editor to Treat β-Hemoglobinopathies. Cell Research, 2020,1
